"met het blote oog goed zichtbare, ongewervelde dieren die ten minste een deel van hun leven in het water of op de waterspiegel doorbrengen"
Hieruit blijkt dat de groep vooral is gedefinieerd op basis van afmetingen. Dit vanwege de gebruikelijke vangstmethode, namelijk met een schepnet met een maaswijdte van 0,5 mm. Zo wordt een deel van de kreeftachtigen tot de macrofauna gerekend, maar de veelal kleinere kreeftachtigen zoals watervlooien en mosselkreeftjes niet. Daarom is macrofauna in taxonomisch opzicht geen homogene of goed afgebakende groep. De afmetingen worden echter niet strikt gehanteerd. Voor een deel is de opvatting van wat tot de macrofauna hoort alleen te verklaren vanuit traditie. Watermijten behoren wel tot de macrofauna, de vaak even grote watervlooien niet. Een taxonomische aspect aan de definitie is dat het om ongewervelden (evertebraten, of in het Engels: invertebrates) gaat. Dit betekent dat vissen en amfibieën niet tot de groep macrofauna worden gerekend (hoewel die soms wel in het net terecht komen). In dit opzicht zou de term macro-evertebraten daarom correcter (of in ieder geval beter te begrijpen) zijn dan de term macrofauna. Maar omdat de term macrofauna in Nederland veel gangbaarder is, houden we het in de handboek ook bij die term.
In de Kaderrichtlijn Water wordt ook wel de term macro-zoöbenthos gebruikt. Dat duidt meer op de (grote) ongewervelde dieren die in of op de bodem leven. Uit de CIS-Guidances (bijvoorbeeld nr. 7 over Monitoring) blijkt dat de KRW wel degelijk de volledige groep macrofauna bedoelt, dus ook de vrij zwemmende soorten, of soorten die bijvoorbeeld op en tussen de vegetatie leven.
Van deze groepen worden bij onderzoek voor het waterbeheer alleen de daadwerkelijk in of op het water levende soorten en stadia betrokken. Van verschillende groepen insecten zoals libellen en dansmuggen gaat het dus vooral om de larven.
Elke soort (dit geldt niet alleen voor macrofauna, maar voor alle dieren en planten) heeft zijn eigen milieu-preferenties. De ecologische amplitudo kan groot of klein zijn. Dit betekent dat sommige soorten alleen in zeer specifieke milieu's voorkomen terwijl andere soorten in een diversiteit aan milieus worden aangetroffen. Onder de macrofaunasoorten is dat niet anders. Er zijn soorten die alleen in bepaalde typen bronnen in Zuid-Limburg voorkomen, en soorten die bijna door het hele land, in stromend en stilstaand water worden aangetroffen. Zeldzame soorten zijn vaak soorten die hoge eisen stellen aan het milieu en zijn daarmee vaak kenmerkend voor een bepaald watertype. In de KRW-maatlat speelt het aantal kenmerkende soorten daarom ook een rol.
Macrofauna is sterk
indicatief voor chloridegehalte, zuurgraad, stroming, mate van organische
belasting (saprobie) en de aanwezigheid en functionaliteit van substraten en
structuren. Stroming bijvoorbeeld heeft een fysieke invloed op macrofauna. Sommige soorten
hebben zich op specifieke wijze aangepast aan de stroming of zijn zelfs
afhankelijk van de stroming, bijvoorbeeld passieve filtreerders die
voedseldeeltjes uit het water onderscheppen. Andere soorten zijn niet bestand
tegen stroming. Macrofauna is daardoor een goede indicatorgroep voor de
beoordeling van het stromend karakter
van beken.
De substraten en structuren vormen het landschap waarin de macrofauna leeft, en waaraan ze fysiek en in gedrag zijn aangepast. De kokerjuffer Tinodes waeneri weeft een tunnel op hard substraat, de libellenlarve Brachytron heeft een grote voorkeur voor stengels van oeverplanten en de worm Limnodrilus hofmeisteri leeft in slibbodems. Wat op het eerste gezicht een stortstenen oever lijkt, kan door een laagje slib een voor hard-substraat bewoners ongeschikt habitat zijn. Het hard substraat functioneert dan niet als hard substraat. In combinatie leveren de aanwezige soorten een beeld van de bruikbaarheid van de substraten en structuren voor macrofauna.